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    • 专利摘要:
    Es werden Aspernigrin B (1) sowie Aspernigrin-B-Derivate der allgemeinen Formel 2 DOLLAR F1 beschrieben sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Aspernigrin B (1) besitzt eine ausgeprägte neuroprotektive Wirkung.
    公开号:DE102004002884A1
    申请号:DE102004002884
    申请日:2004-01-20
    公开日:2005-08-18
    发明作者:Gerhard Prof. Dr. Bringmann；Rainer Dr. Ebel；Tobias Gulder；Jan Dr. Hiort；Katja Maksimenka；Werner E.G. Prof. Dr. Müller；Sanja Dr. Perovic-Ottstadt；Peter Prof. Dr. Proksch；Karsten Dr. Schaumann
    申请人:Johannes Gutenberg-Universitaet Mainz；Julius-Maximilians-Universitaet Wuerzburg；
    IPC主号:A61K31-4433
    专利说明:
    [0001] Dievorliegende Erfindung betrifft neue bioaktive Verbindungen aus marinenOrganismen, die als Aspernigrin B(1) und dessen Derivate bezeichnetwerden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellungder Verbindungen, diese enthaltende Arzneimittel und deren Verwendungbei der Behandlung von Erkrankungen.
    [0002] MarineOrganismen, speziell Schwämmeund deren assoziierte Mikroorganismen, stellen eine sehr reicheQuelle fürbioaktive Substanzen dar (Sarma AS, Daum T, Müller WEG (1993) Secondary metabolites frommarine sponges. Akademie gemeinnützigerWissenschaften zu Erfurt, Ullstein-Mosby Verlag, Berlin; Prokschet al. (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:125-134). Grund hierfür ist dieTatsache, daß dieseVielzeller sessile Organismen sind, die sich von den im Umgebungsmilieuvorhandenen Mikroorganismen ernähren.Hierfürbrauchen sie effiziente Abwehrmechanismen, um sich vor Bakterien-und Pilzinfektionen zu schützen.Die aktivsten Abwehrsubstanzen stellen solche sekundäre Metabolitedar, die von den Symbionten gebildet werden, die in den marineneukaryontischen Organismen vorkommen. Deshalb bleibt es in den meisten Fällen bisheute unklar, ob der Wirt (Schwämme,Hydrozoen, Bryozoen und Tunikaten) oder die mit ihnen häufig ineiner Symbiose lebenden Mikroorganismen (Pilze, Bakterien) die Produzentenfür diebioaktiven Substanzen sind (Althoff et al. (1998) Marine Biol. 130:529-536;Wiens et al., Marine Biol.; im Druck; Proksch et al. (2002) Appl.Microbiol. Biotechnol. 59: 125-134). In den letzten Jahren hat sichauch erwiesen, daß Schwämme Abwehrmechanismenbesitzen, um Viren zu eliminieren (Grebenjuk et al. (2002) Europ.J. Biochem. 269: 1382-1392). Folglich ist es ein Hauptziel der Forschung,diese Mikroorganismen in Kultur zu züchten und sie dort ihre bioaktivenSubstanzen produzieren zu lassen.
    [0003] Eskann heute angenommen werden, daß weniger als 5% der in marineneukaryontischen Organismen vorkommenden Bakterien und Pilze kultivierbarsind. Folglich ist auch deren Potenzial kaum genutzt. Zur erfolgreichennachhaltigen Nutzung des bioaktiven Potenzials ist es deshalb notwendig,optimale Kultivierungsmethoden fürMikroorganismen zu entwickeln, mit hoher Ausbeute die bioaktivenSubstanzen aus der Biomasse und aus dem Medium zu gewinnen, um diesemit effizienten Reinigungs- und Charakterisierungsverfahren zu identifizieren.Bis heute ist nur ein Medikament in die klinische Therapie eingeführt, dasvon marinen eukaryontischen Organismen produziert wird, das 9-β-D-Arabinofuranosyladenosin[araA] (Mülleret al. (1977) Ann. New York Acad Sci 284:34-48). Das Ziconotid,ein analgetisch wirksames Peptid aus Conus-Meeresschnecken, wirddemnächstin den USA als neues Schmerzmittel auf den Markt kommen (Prokschet al. (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 125-134).
    [0004] DasAnwendungsspektrum füreine kommerzielle Nutzung der bioaktiven Sekundärmetabolite ist breit und reichtvon der Behandlung von Tumoren, der Therapie von Infektionen hervorgerufendurch Bakterien, Viren und/oder Pilzen bis hin zur Therapie vonneurodegenerativen Erkrankungen.
    [0005] Intensivwird dabei auch nach solchen Substanzen gesucht, die eine Behandlungvon bisher kaum therapierbaren neurodegenerativen Erkrankungen,wie z. B. von Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson oder MultiplerSklerose, ermöglichen.
    [0006] Esist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue bioaktiveSubstanz aus einem marinen Organismus und strukturell verwandteVerbindungen, Verfahren zu deren Herstellung und zu deren Verwendungzur Verfügungzu stellen.
    [0007] Erfindungsgemäß wird dieseAufgabe zunächstdurch das Zur-Verfügung-Stellenals Aspernigrin B(1) und Aspernigrin-B-Derivate (2) bezeichneterbioaktiver Substanzen gelöst.Die Aspernigrin-B-Derivate (2) waren bislang unbekannt, ebenso wiedie absolute Konfiguration von Aspernigrin B(1) selbst. Daher warauch ihr medizinisches Wirkungsspektrum, wie auch das von AspernigrinB(1) selbst, bislang unbekannt.
    [0008] Eswurde nun überraschendgefunden, daß AspernigrinB und die davon abgeleite ten Aspernigrin-B-Derivate der allgemeinenFormel 1 und 2 ausgeprägteneuroprotektive Eigenschaften besitzen.
    [0009] Intrazelluläres freiesCalcium [Ca2+]i istein sehr wichtiger Second-Messenger in der Stimulation von vielenZellen. Die Mobilisation von Calcium spielt auch eine sehr große Rollebei verschiedenen Krankheiten, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungendes ZNS, Ischämie,Alzheimer-Krankheit, psychopathologischen Krankheiten und bei Alterungsprozessen.Dabei ist sowohl bei diesen Erkrankungen, als auch bei direktenVerletzungen des Gehirns eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentrationfestzustellen. Dieser erhöhteEinstrom von Ca2+ führt über eine Reihe von weiterenMechanismen zur fortschreitenden Zellzerstörung.
    [0010] NeueSubstanzen wie das hier beschriebene Aspernigrin B(1), die die intrazelluläre Ca2+-Konzentration ((Ca2+]i)senken (z. B. nach der Inkubation mit Neurotoxinen oder Neurotransmittern),könntenin Zukunft in der Behandlung von derartigen Erkrankungen eine große Rollespielen.
    [0011] Erfindungsgemäß werdensomit Verbindungen der allgemeinen Formel 2:
    [0012] Auchkönnenzwei oder mehr Reste R/X (z.B. R8 mit R1 oder/und R2, R2 mit R3 oder/undR4, R3 bzw. R4 mit R5 oder/undR7, X mit R6 oder/undR7 sowie R5 mitR6) so untereinander verknüpft sein,daß dadurchein iso- oder heteroaromatischer oder (teilweise) gesättigterRing erhalten wird. So kann z. B. R5 plusR6 auch ein an zwei benachbarten Kohlenstoffatomendes Pyridongerüstskondensierter aromatischer oder (teilweise) gesättigter Ring sein.
    [0013] ImFalle von R3 ≠ R4 oderbei sterisch anspruchsvollen (d.h. großen, raumfüllenden oder auch „sperrigen") Arylresten, z.B. mit voluminösenortho-Substituenten versehenen R1 und R2 sowie R5–R7 kann die Verbindung zentro- oder axialchiralsein; die Erfindung betrifft in diesen Fällen alle auftretenden Stereoisomere (wieauch das Racemat).
    [0014] Dabeibesteht die Maßgabe,daß Formel2 nicht die folgende Formel 1 bedeutet:
    [0015] ImRahmen der vorliegenden Erfindung soll ein "Derivat" eine von der allgemeinen Formel 2 abgeleiteteVerbindung sein, die zum Beispiel durch verschiedene der oben für R1 bis R8 und X angegebenenRestgruppen substituiert ist, sowie Gemische verschiedener dieserVerbindungen, die zum Beispiel zu einem auf die jeweils zu therapierendeErkrankung und/oder den Patienten auf Basis von diagnostischen oderDaten überden Behandlungserfolg oder -verlauf abgestimmten "personalisierten" Medikament verarbeitetwerden können.Unter einem Derivat wird auch eine Verbindung der Aspernigrin-B-Klasseverstanden, die aus anderen (z. B.) marinen Organismen isoliertwerden kann, als den hier (beispielhaft) erwähnten.
    [0016] Untereinem "Vorläufer" einer Substanz sollim Rahmen der vorliegenden Erfindung zum einen eine Substanz verstandenwerden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch dieBedingungen im Körper(z. B. pH im Magen oder ähnliches)so verändertwird oder aber durch den Körpernach Aufnahme so metabolisiert wird, daß sich als wirksame Substanzdie erfindungsgemäße Verbindungoder deren Derivate bilden. Zum anderen werden als Vorläufer ausOrganismen isolierte Derivate von Aspernigrin B(1) verstanden, dieals Ausgangsprodukte zur Synthese der Verbindung in dem jeweiligenOrganismus dienen und bereits die hierin angegebenen Eigenschaftendes Aspernigrins B(1) aufweisen.
    [0017] Eswurde nun gefunden, daß AspernigrinB(1) und die von dieser Substanz abgeleiteten Aspernigrin-B-Derivate2 eine ausgeprägteund nicht vorhersehbare neuroprotektive Eigenschaft besitzen. Eswird empfohlen, diese Substanzen entweder in der vorliegenden Formoder in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten,pharmazeutisch verträglichenVerdünnungslösung oderTrägersubstanzanzuwenden.
    [0018] AspernigrinB(1) ist ein Naturstoff und die Aspernigrin-B-Derivate der allgemeinenFormel 2 sind davon abgeleitete Syntheseprodukte, die bisher unbekanntwaren und deren Wirkung nicht beschrieben ist.
    [0019] Dieseerfindungsgemäßen Verbindungenkönnenmit den üblichenLösungsmitteln, Hilfs-und Trägerstoffenzu Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions-und Infusionszubereitungen verarbeitet werden, um therapeutischzur peroralen, rektalen oder parenteralen Applikation Verwendungzu finden.
    [0020] Dievorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Herstellungeiner oben genannten Verbindung, das dadurch gekennzeichnet ist,daß dieSubstanz aus einem marinen Organismus, wie zum Beispiel einem auseinem marinen Schwamm der Gattung Axinella damicornis (Porifera)isolierten Pilz der Gattung Aspergillus, z. B. aus Aspergillus niger,gewonnen wird. Aspernigrin B(1) wird unter den nachstehend aufgeführten Kulturbedingungensowohl in das Kulturmedium abgegeben, als auch im Pilzbiomasse angereichert. Beider vorliegenden Spezies handelt es sich um eine seit langem bekannteArt, die bisher nur als Bewohner terrestrischer Biotope beschriebenwar. Das vorliegende Pilzisolat (Pilzstamm) entstammt jedoch demmarin-aquatischen Lebensraum.
    [0021] Dievorliegende Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer deroben genannten Verbindungen der allgemeinen Formel 2 zur Behandlungneurodegenerativer Erkrankungen, wie z. B. Morbus Alzheimer oderMorbus Parkinson. Diese Verwendung kann z. B. in Form einer Depotsubstanzoder als Vorläuferzusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichenVerdünnungslösung oderTrägersubstanzerfolgen.
    [0022] Einweiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutischeZusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, zusammen mitgeeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen. Diese pharmazeutische Zusammensetzungkann dadurch gekennzeichnet sein, daß die Verbindung in Form einerDepotsubstanz oder als Vorläuferzusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichenVerdünnungslösung oderTrägersubstanzvorliegt.
    [0023] DieErfindung soll nun im Folgenden anhand von Beispielen näher verdeutlichtwerden, ohne jedoch auf diese Beispiele irgendwie beschränkt zu sein.In den beigefügtenFiguren zeigt:
    [0024] 1:Die Aufklärungder absoluten Konfiguration von Aspernigrin B(1) durch Vergleichder experimentell gemessenen CD-Spektren (in Methanol) mit den berechnetenSpektren für(R)-1 und (S)-1 nach a) der TRIPOS-MD-Methode und b) dem AM1-Bolzmann-Ansatz.
    [0025] 2:Die Behandlung der Neuronen mit 200 μM L-Glutaminsäure und2,5 mM Ca2+ (♦); Präinkubation der Neuronen mit1 (Δ) und5 (o) μg/mlAspernigrin B(1) nach Zugabe von 200 μM L-Glu und 2,5 mM CaCl2
    [0026] 3:Die Inkubation der Neuronen mit 317 μM Quisqualinsäure (QUIS)und 2,5 mM Ca2+ (♦); Präinkubation der Neuronen mit1 (o) μg/mlAspernigrin B(1) nach der Zugabe von 317 μM QUIS und 2,5 mM CaCl2
    [0027] EinPilz der Art Aspergillus niger van Tieghem wird als Produzent desNaturstoffes Aspernigrin B(1) nachgewiesen. Aspernigrin B(1) wirdunter den nachstehend aufgeführtenKulturbedingungen sowohl in das Kulturmedium abgegeben als auchin der Pilzbiomasse angereichert. Die Gattung Aspergillus zeichnetsich durch eine Vielzahl weit verbreiteter Spezies aus, die zumTeil beachtliche biochemische Potenzen besitzen. Die vorliegendeArt ist als Bewohner terrestrischer Biotope beschrieben. Das vorliegendePilzisolat (Pilzstamm) entstammt jedoch dem marin-aquatischen Lebensraumund wurde aus dem marinen Schwamm Axinella damicornis (Porifera)isoliert.
    [0028] Dervorliegende Pilzstamm von Aspergillus niger wurde im April 1999aus dem marinen Schwamm Axinella damicornis aus 20m Wassertiefein der Bucht von Fetovaia (42°42'24"N/10°09'31"E) auf Elba, Italien,isoliert. Der Schwamm wurde sofort nach der Entnahme mit Hilfe einschlägiger marin-mykologischerMethoden auf seinen Pilzbesatz hin untersucht. Die vorliegende Isolationwurde durch Auslegen kleiner Gewebestückchen des sezierten Schwammesauf einer Nähragarplattefolgender Zusammensetzung (GPYNS, Schaumann et al. (1974) Mar. Biol.28: 221-235) gewonnen:
    [0029] Durchmehrere Reinigungsstufen wurde die primäre Rohkultur zu einer axenischenReinkultur weitergezüchtet.Die Stammkultur erfolgt auf GPYNS-Schrägagarröhrchen.
    [0030] DieAnzucht der Pilzkultur fürdie Gewinnung des neuen Naturstoffes Aspernigrin B (1) erfolgt in 1-L-Erlenmeyerkolben,die mit je 300 ml Nährlösung folgenderZusammensetzung (WS, Wickerham et al. (1951) US Dept. Tech. Bull.1029: 1-56) beschickt wurden:
    [0031] DieSterilisation der Nährlösung erfolgtdurch Autoklavieren bei 121°C/1bar, 15 Minuten. Als Inokulum fürdie experimentelle Pilzkultur dienen zehn Stück Myzelscheibchen (Durchmesser5 mm) je Kolben. Diese werden aus einer 7 Tage alten Vorkultur aufWS-Agar mit Hilfe eines Korkbohrers ausgestanzt und in die Nährlösung. DieInkubation der beimpften Kolben erfolgt über einen Zeitraum von 14 Tagenbei kon stanter Temperatur von 20°Cin statischer Kultur. Anschließendwird das gewachsene Myzel einschließlich der Kulturbrühe abgeerntet,mit 10 Volumenprozent Ethylacetat versetzt und bei –80°C bis zurExtraktion aufbewahrt.
    [0032] ZurExtraktion werden vorzugsweise Methanol, Dichlormethan und Essigestereingesetzt, es sind aber auch andere Lösungsmittel wie Ethanol, Propanol,Butanol, Ether, n-Hexan, Benzin, Toluol, Aceton, Methylethylketon,Essigsäure-Tertiärbutylesterdenkbar. Die erhaltenen Extrakte werden im Vakuum bis zur Trockne eingeengtund, eventuell nach Vorfraktionierung durch Flüssig-Flüssig-Extraktion, mit Hilfeeines oder mehrerer chromatographischer Verfahren aufgetrennt. Vorzugsweisewird hierfürdie präparativeHPLC an 'reversed-phase'-Material (RP18)mit einem Wasser/Acetonitril- oder einemWasser/Methanol-Gradienten verwendet. Als stationäre Phasenkönntenauch Siliciumdioxid, Aluminiumoxid oder Cellulose Verwendung finden oderes könnteFlüssig-Flüssig-Chromatographie,z. B. FCPC, eingesetzt werden. Es werden verschiedene Fraktionengesammelt und durch HPLC oder Dünnschichtchromatographieauf ihren Gehalt an den erfindungsgemäßen Verbindungen untersucht.Nach Einengen der in Frage kommenden Fraktionen erhält man die Verbindungenin reiner Form.
    [0033] Bei300-ml-Kulturansätzenwurden Myzel und Kulturmedium homogenisiert und erschöpfend mit Ethylacetatextrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden mit salzfreiem Wassergewaschen und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Extrakt wurdeanschließendzwischen Methanol/Wasser (90:10) und Cyclohexan verteilt.
    [0034] DerMethanol/Wasser-Extrakt wurde anschließend mittels VLC (Silica Gel)mit Dichlormethan und iso-Propanol als Lösungsmittelsystem aufgetrennt.Weitere Aufreinigung überSephadex LH-20 Säulenchromatographiemit Methanol als Eluent und abschließender Aufreinigung an einerRP-18 Lobarsäulemit einem Methanol/Wasser Lösungsmittelsystemlieferte reines Aspernigrin B(1).
    [0035] Dasso gewonnene Aspernigrin (1) hat folgende tabellarisch zusammengefasstespektroskopische Eigenschaften:
    [0036] DieVerbindung liegt als farbloses Ölvor.
    [0037] Ausden oben genannten spektroskopischen Daten konnte die Konstitutiondes Aspernigrins B(1) abgeleitet werden (Dissertation Jan Hiort;Düsseldorf2002), nicht jedoch die Stereostruktur.
    [0038] Dieabsolute Konfiguration von Aspernigrin B(1) konnte nun per Circular-Dichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie)zugeordnet werden. Bedingt durch den bislang unbekannten Strukturtypwar der empirische Vergleich mit den CD-Spektren strukturell verwandter Verbindungenmit bekannter Absolutkonfiguration nicht möglich, so daß modernequantenmechanische Berechnungen (Bringmann et al. (2002) J. Org.Chem. 67: 5595-5610), die sich fürdie Interpretation von CD-Spektrenals allgemein anwendbar erwiesen haben, zum Einsatz kamen.
    [0039] Umdie Flexibilitätdes Molekülszu berücksichtigen,wurde ein molekulardynamischer (MD) Ansatz gewählt (Bringmann et al. (2001)J. Comput. Chem. 22:1273–1278).Diese MD-Simulation wurde bei einer virtuellen Temperatur von 500Kelvin unter Benutzung des TRIPOS-Kraftfeldes (SYBYL; Tripos Associates:1699 Hanley Road, Suite 303, St. Louis, MO 63144) durchgeführt. Diejeweiligen CD-Spektrenfür dieverschiedenen Geometrien von Aspernigrin B(1) wurden durch Anwendungder semiempirischen CNDO/2S-Methode (Bene et al. (1968) J. Chem.
    [0040] Phys.48: 1807-1813) berechnet. Die Summe aus den so einzeln berechnetCD-Spektren ergabdie CD-Kurven der beiden Enantiomere.
    [0041] Dabeizeigte die berechnete Kurve fürdas S-Enantiomer von Aspernigin B(1) gute Übereinstimmung mit dem experimentellgemessenen Spektrum (1a).
    [0042] Zurweiteren Absicherung wurde die CD-Kurve von Aspernigrin B(1) auch über denzweiten fürCD-Berechnungen möglichenAnsatz, der auf einer Konformationsanalyse beruht, berechnet. Eswurden die CD-Spektren von 172 verschiedenen Konformeren, derenEnergie in einem Bereich von bis zu 3 kcal/mol um dem globalen Minimumlag, unter Verwendung der oben beschriebenen CNDO/2S-Methode berechnet,und entsprechend der Besetzung dieser Energieniveaus im Gleichgewichtszustandgewichtet und aufaddiert. Das aus dieser Boltzmann-Gewichtung errechneteSpektrum fürdas S-Enantiomer zeigte noch größere Übereinstimmungmit dem experimentell ermitteltem Spektrum (1b).
    [0043] Diegute Übereinstimmungdes experimentell gemessenen Spektrums von Aspernigrin B(1) mitdem fürdas S-Enantiomer von 1 berechnetem und der spiegelbildliche Verlaufim Vergleich zum Spektrum, das für dasR-Enantiomer berechnet wurde zeigt klar, daß Aspernigrin B(1) S-Konfigurationhaben muß.Die Simulation der CD Kurven fürbeide Enantiomere, gefolgt von dem Vergleich mit dem experimentellenSpektrum, führteso zur zweifelsfreien Aufklärungder Stereostruktur des Naturstoffes Aspernigrin B(1) als S (siehe 1).
    [0044] Materialund Methoden: Es wurden die gleichen Materialien wie in Perovicet al. (1998, Mech. Ageing Dev. 101:1-19) beschrieben verwendet.Fura-2-acetoxymethylester(Fura-2-AM) wurde von Molecular Probes (Leiden, Niederlande), DMEM/HGvon Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) und die Antikörper Mäuse-Anti-Neurofilament(68 kDa) und Mäuse-Anti-Glial-Fibrillary-Acidic-Protein(GFAP) von Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) bezogen.
    [0045] Primäre Neuronen:Die kortikale Zellkultur wurde aus den Gehirnen von 17-18 Tage altenRattenembryonen nach einer modifizierten Prozedur erstellt (Freshney,(1987) Culture of specific cell types. In: Culture of Animal Cells.A Manual of Basic Technique, A.R. Liss, New York, S. 257-288; Perovicet al. (1994) Eur. J. Pharmacol. (Mol. Pharmacol. Sec. 288:27-33).Nach der Isolation wurden die Cerebral-Hemisphären in Hanks-Balanced-SaltSolution (HBSS) ohne Ca2+ und Mg2+ gelegt und anschließend die neuronalen Zellenin HBSS mit Hilfe von 0,025% (w/v) Trypsin (10 Min.; 37°C) dissoziiert.Die proteolytische Reaktion wurde mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum(FKS) beendet. Die Einzelzellsuspension wurde zentrifugiert unddas resultierende Pellet in Dulbecco's-Modified-Eagles's-Medium mit 4,5 g/L Glucose (DMEM/HG)(enthält2 mM L-Glutamin, 100 mU/L Insulin und 10% (v/v) FKS) aufgenommen.Die Zellen wurden in eine mit Poly-L-Lysin (5 μg/ml, 300 μl/cm2)beschichtete Kammer mit einer Zelldichte von 2,0 × 105 Zellen/cm2 ausplattiert.Nach Das zwei Tagen wurde das DMEM/HG/10% FKS-Medium entfernt unddurch DMEM/HG/Serum-freiem Medium ersetzt. Zwei Wochen nach derIsolation erfolgte die Immunfärbungmit Anti-Neurofilament 68 kDa als Macker für Neuronen und Anti-GFAP alsMarker fürGliazellen. Die Kulturen beinhalteten > 80% Neuronen; die restlichem 20% warenGFAP-positive Zellen (hauptsächlichAstrozyten; Ushijima et al. (1995) Eur. J. Neurosci. 7:1353-9).Die Neuronen wurden in einer Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO2 bei 37°Cgehalten.
    [0046] Ladenvon Neuronen mit Fura-2-AM: Die intrazelluläre Ca2+-Konzentration([Ca2+]i) wurde durch Fluoreszenzmessungenbestimmt. Ausschlaggebend war das Verhältnis des Ca2+-IndikatorfarbstoffesFura-2-AM bei 340 und 380 nm (Grynkiewicz et al. (1985) J. Biol.Chem. 260:3440-50). Die Neuronen wurden mit 6 μM Fura-2-AM in DMEM/HG/ Serum-freiesMedium (versetzt mit 1 % (w/v) BSA) bei 37°C für 90 Min. beladen. Nach Inkubationwurden die Zellen zweimal mit Medium gewaschen und für weitere60 Min. bei 37°Cinkubiert. Diese Inkubationszeit ist ausreichend, um die Neuronenzu beladen (inaktives Fura-2-AM) und den Acetoxymethylester (aktivesFura-2) zu hydrolysieren.
    [0047] Calcium-Kalibrierungskurve:Eine Calcium-Kalibrierungskurve wurde nach den Methoden von Grynkiewiczet al. (1985, J. Biol. Chem. 260:3440-50) erstellt. Fluoreszenzbilderwurden fürjeden Puffer bei 340 und 380 nm erhalten. Der Quotient aus den beidenFluoreszenzspektren (340/380 nm) wurden berechnet und als Kalibrierungskurvedargestellt. Ein Wert (1,0) aus diesem Quotient (340/380 nm) entspricht228 nM [Ca2+]i .
    [0048] Änderungendes Calciumspiegels in Neuronen: In allen Versuchsansätzen wurdendie Zellen zuerst mit Fura-2-AM beladen und anschließend mitunterschiedlichen Substanzen (in Locke's Lösung;154 mM NaCl; 5,6 mM KCl; 3,6 mM NaHCO3;5,6 mM Glucose and 10 mM Hepes; pH 7,4; ohne CaCl2)stimuliert. Die Testsubstanz (1) wurde in 100% (v/v) DMSO (Konz.10 mg/ml) gelöstund bei –20°C gelagert.Neuronen wurden im ersten Ansatz 5 Min. mit 0,1% (v/v) DMSO (Kontrolle)stimuliert; nach 10 Min. wurden 317 μM Quisqualinsäure (QUIS),200 μM L-Glutaminsäure (L-Glu)und 2,5 mM CaCl2 zu den Zellen gegeben.Im zweiten Ansatz wurde die Auswirkung von QUIS, L-Glu) und 2,5mM CaCl2 auf den Calciumspiegel vorinkubierterNeuronen (jeweils 5 Min. mit 1 und 5 μg/ml der Substanz 1) getestet.Der [Ca2+]i Spiegelwurde in allen Experimenten fürmindestens 20-25 Min. gemessen.
    [0049] ZurBestimmung des [Ca2+]i wurdendie Zellen auf Poly-L-Lysin beschichteten Borsilikat-Deckgläsern im4-Kammer-System (Lab-Tek Chamber Slide TM-System; Nunc, Wiesbaden,Deutschland) kultiviert. Mit einem „inverted-stage"-Mikroskop (OlympusIX70) mit apochromatisch reflektiertem Licht und dem FluoreszenzobjektivUApo40X/340 wurden die Fluoreszenzmessungen durchgeführt. DieZellen wurden alternierend mit Licht der Wellenlängen 340 und 380 nm mit Hilfeeines computergesteuerten Schmalband-Interferenzfilters vor einer100-W-Xenon-Lampe beleuchtet. Zusätzlich wurde für 380 nmein 0,25-ND-Filter benutzt. Die Fluoreszenzemissionen bei 510 nmwurden mit einer CCD-Kamera (Modell C2400-87; Hamamatsu, Herrsching, Deutschland)aufgezeichnet. Die Bilder wurden computergestützt mit dem Imaging-SystemArgus 50, Hamamatsu, digitalisiert als 256 × 256 Pixel mit 8-bit-Arrays. Der Fluoreszenzquotient340/380nm wurde durch Division der Bilderpaare ermittelt.
    [0050] Statistik:Die Ergebnisse wurden mittels des gepaarten „Student's t-test" (Sachs (1984) Angewandte Statistik.Springer, Berlin) ausgewertet.
    [0051] Einflussvon Aspernigrin B(1) auf den [Ca2+]i-Spiegelin neuronalen Zellen: Die Zugabe von 1 und 5 μg/ml Aspernigrin B(1) zeigtefast keinen Effekt auf [Ca2+]i inneuronalen Zellen.
    [0052] Einflussvon L-Glutaminsäureauf [Ca2+]i-Spiegelin An- oder Abwesenheit von Aspernigrin B(1) in neuronalen Zellen:Inkubation der Zellen mit 200 μML-Glutaminsäure und2,5 mM Ca2+ (2) ergabeinen starken Anstieg von [Ca2+]i nach 10 Min. Am Ende der Messung stiegendie 340-/380-nm-Werte um 1,652 ± 0,128 (284%). Die Kontrollewurde dabei als 100% angenommen. Eine Präinkubation der Neuronen mit1 und 5 μg/ml AspernigrinB(1) bewirkte einen Abfall des [Ca2+]i-Spiegelsnach der Zugabe von 200 μML-Glu und 2,5 mM CaCl2. Der Abfall im [Ca2+]i-Spiegel warsignifikant und betrug etwa 25,5% bei 1 μg/ml (2) und 55,0%bei 5 μg/ml(p<0,001, 2).Bei Zugabe von L-Glutaminsäurezeigte sich eine starke Erhöhungvon [Ca2+]i in neuronalenZellen. Aspernigrin B(1) hebt diese Steigerung in einer stark dosisabhängigen Weiseauf.
    [0053] Einfluß von Quisqualinsäure auf[Ca2+]i-Spiegelin An- oder Abwesenheit von Aspernigrin B(1) in neuronalen Zellen:Zugabe von 317 μMQuisqualinsäure(QUIS) und 2,5 mM Ca2+ zu den Zellen (3)ergab einen starken Anstieg von [Ca2+]i nach 10 Min. Am Ende der Messung stiegendie 340-/380-nm-Werte um 1,207 ± 0,245 (258%). Die Kontrollewurde dabei als 100% angenommen. Die Abnahme der freien Calciumkonzentrationin Neuronen nach der Präinkubationmit 1 und 5 μg/mlAspernigrin B(1) und anschließenderInkubation mit 317 μMvon QUIS war nicht signifikant; im Vergleich zur Kontrolle warendie Werte um 33,6% (1 μg/ml 3)und 23,5% (5 μg/ml,die Daten wurden nicht gezeigt) gesunken.
    [0054] Eswurde gefunden, daß Zellen,die mit Aspernigrin B(1) inkubiert wurden, nach der Zugabe von L-Glutaminsäure einenstarken Abfall des intrazellulärenCalciumspiegels zeigten. L-Glutaminsäure ist als Neurotransmitterin einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen etiologisch involviert.Aufgrund dieser Eigenschaften könnteAspernigrin B(1) sehr erfolgreich sein in der Behandlung der genanntenErkrankungen und den damit verbundenen Symptom-Komplexen.
    [0055] AspernigrinB(1) hat einen Effekt (die Abnahme betrug 23-33%) auf die freieCa2+-Konzentrationnach der Zugabe von Quisqualinsäure(QUIS). Quisqualinsäurewirkt als ein starker mGlu-Rezeptpor-Agonist. Intraspinale Injektionvon QUIS produziert massive excitotoxische und pathologische Schädigungenvon Neuronen, die ähnlichden Schädigungenbei cerebraler Ischämieoder nach traumatischen Spinalkanal-Verletzungen sind. Im Falle von Ischämie undSpinalkanal-Verletzungen ist die Prüfung einer Behandlung mit Aspernigrin B(1)in Erwägungzu ziehen.
    权利要求:
    Claims (6)
    [1] Verbindung der allgemeinen Formel 2:
    [2] Verbindungen der allgemeinen Formel 1 oder Formel2 nach Anspruch 1 als Medikament.
    [3] Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Präventionoder Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen.
    [4] Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend einetherapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1, gegebenenfallszusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen.
    [5] Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 4,dadurch gekennzeichnet, daß dieVerbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammenmit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oderTrägersubstanzvorliegt.
    [6] Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 oder5 in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen,Suppositorien, Injekti ons- oder Infusionszubereitungen zur peroralen,rektalen oder parenteralen Verwendung.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE102004002884B4|2007-10-25|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2005-08-18| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
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    2009-11-19| 8339| Ceased/non-payment of the annual fee|
    优先权:
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